子科生物報道：人類的許多遺傳病是由基因組中的突變引起的。因此，科學(xué)家在不斷尋找工具去編輯或修復(fù)遺傳代碼中的這些錯誤。CRISPR/Cas9便成為最有希望的技術(shù)之一。利用這把“剪刀”，研究人員能夠改變或刪除某個基因。然而，CRISPR的應(yīng)用也面臨一個問題，那就是同源定向修復(fù)（HDR）的編輯效率太低。

為了應(yīng)對這一問題，哈佛大學(xué)著名的David Liu實驗室在2016年利用Cas9融合蛋白開發(fā)出單堿基編輯器，能夠大大提高堿基編輯的效率。自此，研究人員不斷開發(fā)堿基編輯工具，可在動物、植物和微生物中實現(xiàn)點突變。如今，堿基編輯已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、合成生物學(xué)和作物改良，引起了學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的極大興趣。

早期的堿基編輯器

David Liu實驗室最初利用大鼠的胞苷脫氨酶APOBEC1和dCas9創(chuàng)建出第一代的堿基編輯器（BE1），能夠?qū)奏ぃ–）轉(zhuǎn)化成尿嘧啶（U），從而實現(xiàn)C→T（或G→A）的堿基替換¹。BE1表現(xiàn)出約5個核苷酸的活性窗口，從第4位到第8位。不過，在轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)模型之后，他們發(fā)現(xiàn)編輯效率從44%陡降至0.8-7.7%，這可能是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）參與了堿基切除修復(fù)，去除了DNA中的尿嘧啶。

于是，他們就開發(fā)出第二代的BE2系統(tǒng)，將尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）與dCas9相融合，從而將編輯效率提高了三倍，最高達(dá)到20%。對于BE1和BE2，由于DNA并非直接切割，因此插入缺失的形成非常少（< 0.1%）。

為了讓堿基編輯的效率提高到50%以上，你需要將編輯復(fù)制到另一條DNA鏈上。為此，研究人員將dCas9變身為切口酶，以便模擬錯配修復(fù)。BE3在未修飾的DNA鏈上產(chǎn)生切口，使它看起來像是新合成的。因此，細(xì)胞以含有尿嘧啶的鏈作為模板來修復(fù)DNA，并復(fù)制堿基編輯。

胞嘧啶堿基編輯器的示意圖（圖片來自Addgene）

通過這種方式，BE3系統(tǒng)將各種靶點的編輯效率提高到30%以上，且插入缺失的頻率僅為1.1%。這與Cas9介導(dǎo)的HDR相比是巨大的進(jìn)步，因為HDR介導(dǎo)的編輯效率僅為0.5%，而且觀察到多個插入缺失。不過，此系統(tǒng)也會帶來脫靶效應(yīng)，主要來自Cas9脫靶，而不是APOBEC1。

第三代編輯器的改進(jìn)

日本神戶大學(xué)Akihiko Kondo領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊隨后進(jìn)一步證實了堿基編輯的實用性²。他們將來自海鰻的胞苷脫氨酶與Cas9切口酶相融合，創(chuàng)建了Target-AID堿基編輯器。它的作用方式與BE3類似，但又不完全相同，其編輯窗口位于PAM上游18個堿基處的3-5個堿基。

David Liu實驗室在2017年也生成了帶有其他脫氨酶的BE3變體，包括AID、CDA1和APOBEC3G。他們發(fā)現(xiàn)，CDA1-BE3和AID-BE3能夠比BE3更有效地編輯G后面的C，而APOBEC3G表現(xiàn)出較少的序列偏好。這些結(jié)果表明，特定的脫氨酶以及與Cas9的連接方式會影響編輯的作用和效率³。

之后，David Liu實驗室的研究人員將重點又放在Cas9上。他們利用天然和改造的Cas9變體開發(fā)出五種PAM序列不同的堿基編輯器，從而擴(kuò)大了堿基編輯的目標(biāo)范圍⁴。對于每種堿基編輯器，他們觀察到的最低編輯效率約為50%，并確認(rèn)融合蛋白保留了Cas9的PAM特性。他們還誘變了堿基編輯器的胞苷脫氨酶部分，產(chǎn)生了SpCas9堿基編輯器，其編輯窗口小到只有1-2個核苷酸。

為了減少與堿基編輯相關(guān)的脫靶效應(yīng)，研究人員又建立了高保真版的BE3系統(tǒng)⁵，這個堿基編輯器采用了高保真的Cas9變體——HF-Cas9。隨后，他們利用容易脫靶的gRNA來測試原始的BE3和HF-BE3。他們發(fā)現(xiàn)，HF-BE3的脫靶編輯比BE3低了37倍。為了進(jìn)一步提高特異性，他們純化了HF-BE3蛋白，并以核糖核蛋白顆粒（RNP）形式導(dǎo)入斑馬魚胚胎和小鼠內(nèi)耳。

第四代的堿基編輯器

研究人員觀察到，以BE3為基礎(chǔ)的系統(tǒng)不僅僅會產(chǎn)生C→T，還會產(chǎn)生C→G或C→A。他們假設(shè)，這些副產(chǎn)物是由于尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）切除尿嘧啶而產(chǎn)生的。于是，David Liu實驗室在BE3的基礎(chǔ)上，融合了第二個拷貝的UNG抑制劑，以提高堿基編輯產(chǎn)物的純度。自此，第四代堿基剪輯器BE4產(chǎn)生。與BE3相比，BE4的C→G和C→A產(chǎn)物減少了2.3倍³。

為了進(jìn)一步降低插入缺失的產(chǎn)生，David Liu領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊將噬菌體蛋白Gam融合到BE4的N端。Gam蛋白與雙鏈斷裂的游離端結(jié)合，可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而不是NHEJ修復(fù)，從而將修復(fù)細(xì)胞從編輯細(xì)胞中剔除。因此，Gam與BE4或SaBE4的融合使得插入缺失的頻率降低1.5-2倍。

腺嘌呤堿基編輯器

以往的堿基編輯大多限于C→T的轉(zhuǎn)換，或另一條鏈上G→A的轉(zhuǎn)換。是否能夠?qū)ζ渌麎A基進(jìn)行編輯？還是David Liu實驗室，他們在2017年開發(fā)出一個腺嘌呤堿基編輯器，將腺嘌呤轉(zhuǎn)化成肌苷，從而實現(xiàn)A→G的轉(zhuǎn)換。由于沒有已知的DNA腺嘌呤脫氨酶，他們便通過定向進(jìn)化從RNA腺嘌呤脫氨酶TadA中產(chǎn)生。

經(jīng)過七輪的分子進(jìn)化，研究人員獲得了四種腺嘌呤堿基編輯器（ABE）⁶。ABE7.10是活性最高的編輯器，在目標(biāo)位置4-7的編輯窗口內(nèi)顯示出平均53%的編輯效率。ABE 6.3、7.8和7.9則顯示出較寬的編輯窗口。與CBE不同，ABE不會在目標(biāo)位點處出現(xiàn)A到其他堿基的轉(zhuǎn)換。他們認(rèn)為從DNA中去除肌苷的可能性比較小，從而阻止了堿基切除修復(fù)。

改進(jìn)改進(jìn)再改進(jìn)

當(dāng)然，任何堿基編輯器都不是完美的，于是研究人員開啟了漫長的改造之旅。2018年，David Liu實驗室在《Nature Biotechnology》雜志上發(fā)表文章，顯示表達(dá)水平是堿基編輯效率的一個瓶頸。他們通過修飾核定位信號（NLS）和密碼子使用以及脫氨酶組分的重構(gòu)來優(yōu)化胞嘧啶（BE4）和腺嘌呤（ABE7.10）堿基編輯器。此次產(chǎn)生的BE4max、AncBE4max和ABEmax編輯器可以在各種類型的哺乳動物細(xì)胞中糾正致病性SNP，并大大提高效率⁷。

在堿基編輯這一領(lǐng)域，中國學(xué)者也發(fā)表了大量成果。2018年，中科院遺傳與發(fā)育所的研究人員在前期研究基礎(chǔ)上利用Cas9變體（nCas9-D10A）融合人類胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A（A3A）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI），構(gòu)成新的單堿基編輯系統(tǒng)A3A-PBE，成功在小麥、水稻及馬鈴薯等植物中實現(xiàn)比PBE更加高效的C→T單堿基編輯⁸。

不久前，華東師范大學(xué)的李大力和劉明耀課題組在《Nature Biotechnology》雜志發(fā)表了一種全新的雙堿基編輯器。他們將人類胞嘧啶脫氨酶、腺嘌呤脫氨酶和Cas9切口酶融合在一起，開發(fā)了腺嘌呤和胞嘧啶的雙堿基編輯器A&C-BEmax，它可以在同一等位基因的靶序列上實現(xiàn)C→T和A→G的高效轉(zhuǎn)換⁹。

至于雙堿基編輯器，同期《Nature Biotechnology》雜志上還發(fā)表了麻省總醫(yī)院的另一項成果。J. Keith Joung 團(tuán)隊將腺苷脫氨酶（TadA）、來源于七鰓鰻的胞嘧啶脫氨酶（PmCDA1），分別融合到Cas9切口酶的N端和C端，開發(fā)出一種雙堿基編輯工具SPACE（Synchronous Programmable Adenine and Cytosine Editor），可以同時引入A→G和C→T替代¹⁰。