深圳子科生物報(bào)道：北京時(shí)間2020年6月1日晚23時(shí)，李大力和劉明耀課題組在Nature Biotechnology雜志發(fā)表了全新的雙堿基編輯器：《Dual base editor catalyzes both cytosine andadenine base conversionsin human cells》。

該研究將人類胞嘧啶脫氨酶hAID-腺嘌呤脫氨酶-Cas9n（SpCas9 D10A突變體）融合在一起，開發(fā)了一種新型雙功能高活性堿基編輯器-A&C-BEmax，它可以在同一等位基因的靶序列上實(shí)現(xiàn)C>T和A>G的高效轉(zhuǎn)換。

與CBE和ABE相比，A&C-BEmax拓寬了C>T的編輯窗口，提高了編輯效率；A>G的窗口保持不變，效率略有下降,RNA脫靶水平大幅降低。
2018年David Liu實(shí)驗(yàn)室開發(fā)出ABE7.10堿基編輯器后，李大力課題組通過融合識(shí)別不同PAM的Cas9變體，大幅提高了ABE在小鼠和大鼠胚胎中的編輯效率的同時(shí)大大地拓寬了可編輯的靶點(diǎn)范圍（6）。

然而，無論是ABE還是CBE都只能催化單一堿基的轉(zhuǎn)換，在研究ABE的同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)猜測(cè)如果將兩種脫氨酶融合到Cas9n，是否能實(shí)現(xiàn)兩種堿基高效的轉(zhuǎn)換呢？

因此，通過將胞嘧啶脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶在Cas9n兩端融合，構(gòu)建了五種載體，通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞測(cè)試，發(fā)現(xiàn)將胞嘧啶脫氨酶hAID融合到ABE7.10的N端，展現(xiàn)出A/C同時(shí)轉(zhuǎn)換的特性，但此時(shí)效率偏低。

為了進(jìn)一步提高效率，課題組通過密碼子、核定位信號(hào)、linker序列以及UGI串聯(lián)等多輪優(yōu)化獲得了一種高效的A/C同時(shí)轉(zhuǎn)換的編輯器，并命名為：A＆C-BEmax。

經(jīng)過上述系列優(yōu)化，與原始構(gòu)建體相比，A＆C-BEmax的堿基轉(zhuǎn)化效率，產(chǎn)物純度和A/C同時(shí)轉(zhuǎn)換活性顯著提高，C（胞嘧啶）的編輯窗口大幅拓寬，且更安全，RNA脫靶率更低。

為了公正地評(píng)價(jià)A＆C-BEmax的性能，科研人員在HEK293T細(xì)胞中測(cè)試了28個(gè)內(nèi)源性靶點(diǎn)（其中4個(gè)靶點(diǎn)僅包含Cs或As）同時(shí)和與ABEmax和AID-BE4max進(jìn)行對(duì)比。

測(cè)試顯示， A＆C-BEmax的編輯窗口從C3-C10位擴(kuò)展到了C2-C17位，在C7-C17位的編輯活性相對(duì)于AID-BE4max提高了1.9-14倍，而A>G的編輯效率與ABEmax相似或略有降低，但比ABEmax在RNA上的脫靶率更低，同一等位基因的A和C同時(shí)突變效率最高達(dá)到30％。

那么這么好的工具有什么獨(dú)特的用途呢？論文進(jìn)一步驗(yàn)證了A＆C-BEmax在基因治療中的應(yīng)用，將A＆C-BEmax遞送到紅細(xì)胞前體細(xì)胞中(HUDEP-2)。

結(jié)果表明，A＆C-BEmax能高效地破壞胎兒期血紅蛋白基因HBG1/2啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A結(jié)合位點(diǎn)（-114C>T或-115C>T）并同時(shí)創(chuàng)建新的轉(zhuǎn)錄激活因子GATA1的結(jié)合位點(diǎn)（-113A>G），與周圍單獨(dú)產(chǎn)生C的編輯細(xì)胞相比，分化的HUDEP-2細(xì)胞中更高的HBG表達(dá)水平。

該工作展示了A&C-BEmax這一新型雙堿基編輯系統(tǒng)對(duì)于精準(zhǔn)治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。

最后，與楊力課題組合作，通過大數(shù)據(jù)挖掘，在Clin Var（1）和dbSNP（7） (SNPs)臨床數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了臨床中A＆C-BEmax可同時(shí)靶向AC糾正203個(gè)臨床報(bào)道的致病突變；進(jìn)一步拓展PAM為NG時(shí)， Cas9-靶向范圍增加了2.8倍（?573個(gè)）。

即研究的新工具在理論上可對(duì)數(shù)百種至數(shù)千種引起人類疾病的基因組點(diǎn)突變進(jìn)行定點(diǎn)矯正，因此擁有巨大的臨床應(yīng)用潛力。

研究團(tuán)隊(duì)還統(tǒng)計(jì)到，A&C-BEmax與ABE或CBE相比，能實(shí)現(xiàn)60個(gè)額外的密碼子更改(18個(gè)氨基酸替換)，這些更改無法使用現(xiàn)有的單堿基編輯器做到。

與單脫氨酶堿基編輯器相比，A＆C-BEmax能高效地同時(shí)引入A>G和C>T編輯，因此產(chǎn)生的突變組合多樣性更大，且更安全。

除了基因治療方面，A＆C-BEmax還將在譜系追蹤、飽和誘變篩選和定向進(jìn)化等基礎(chǔ)研究的應(yīng)用中展現(xiàn)巨大潛能。

華東師大生命科學(xué)學(xué)院2016級(jí)博士研究生張曉輝，2017級(jí)博士研究生朱碧云和2018級(jí)碩士研究生陳亮為該論文的共同第一作者，華東師范大學(xué)為第一作者單位，李大力教授為本文通訊作者，劉明耀教授參與課題的指導(dǎo)，該課題得到了中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院計(jì)算生物學(xué)研究所楊力研究員團(tuán)隊(duì)的大力支持。

該研究得到科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金和上海市教委重大項(xiàng)目等項(xiàng)目的經(jīng)費(fèi)支持。

原文標(biāo)題：

Dual base editor catalyzes both cytosine andadenine base conversionsin human cells