深圳子科生物報道：中國科學(xué)院上海巴斯德研究所郝沛研究員，利用RNA編輯策略、編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子合作發(fā)表研究論文:“Interfering with retrotransposition by two types of CRISPR effectors: Cas12a and Cas13a”。該研究利用逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個不同階段的特性，首次采用RNA編輯的策略，實現(xiàn)了對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tf1（類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的模式生物）的編輯干預(yù)。同時，該工作還第一次采用CRISPR-Cas12a對逆轉(zhuǎn)錄病原體的DNA階段進行編輯，達到了100%的編輯干預(yù)效率。

這一研究成果公布在5月19日《Cell Discovery》雜志上。

該研究開拓了對逆轉(zhuǎn)錄病原體（包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）進行編輯干預(yù)的新思路。為RNA編輯和DNA編輯技術(shù)應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒感染阻斷、器官移植中的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒失活、和種質(zhì)資源培育中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子抑制，提供了新的技術(shù)策略和并建立了系統(tǒng)參數(shù)。

近年來，CRISPR系統(tǒng)開始發(fā)展成為對抗逆轉(zhuǎn)錄病原體（包括外源的逆轉(zhuǎn)錄病毒、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子）非常有前途的重要技術(shù)。外源和內(nèi)源性的逆轉(zhuǎn)錄病毒是引發(fā)人體疾病的嚴重起因，也是器官移植（同種和異種器官移植術(shù)）中重大的風險因素。導(dǎo)致疾病的著名外源和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包括HIV-1，HTLV-1，HERV-K 等等。前期科學(xué)家嘗試用CRISPR-Cas9編輯消除病人體內(nèi)的HIV-1，抑制作為器官移植供體的豬體內(nèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERVs），和消除水稻育種中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 Tos17的干擾，取得了一定的進展。

雖然近年來發(fā)現(xiàn)的、專門靶向編輯RNA的 CRISPR第VI亞型 Cas13，為對逆轉(zhuǎn)錄病原體的編輯干預(yù)，提供了新的可能性和技術(shù)策略。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子生命周期中具有DNA和RNA兩個不同階段的特性，理論上RNA編輯的方法可以通過編輯RNA中間體，有效干預(yù)和對抗逆轉(zhuǎn)錄病原體，但這一技術(shù)策略迄今為止尚沒有被探索過。另外，近年來發(fā)現(xiàn)與CRISPR-Cas9類似、作用于DNA的CRISPR第V亞型Cas12a，具有一些優(yōu)秀特性，包括對PAM區(qū)的不同要求、自處理產(chǎn)生crRNA的能力、和更高的靶向效率。但到目前為止尚沒有Cas12a應(yīng)用于編輯干預(yù)逆轉(zhuǎn)錄病原體的報道。本研究卻在以下幾個方面做出了突破性貢獻。

構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報告系統(tǒng)： 

為了應(yīng)用RNA編輯（利用Cas13a）的技術(shù)策略和Cas12對逆轉(zhuǎn)錄病原體編輯干預(yù)，郝沛課題組與合作者首先構(gòu)建了Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的報告系統(tǒng)。他們在Tf1的NEO基因中引入了反向的內(nèi)含子（構(gòu)建多達4種不同的內(nèi)含子序列），這樣Tf1轉(zhuǎn)錄剪接后新形成的Tf1產(chǎn)物、將不具有這些引入的內(nèi)含子。然后通過設(shè)計crRNA，在實驗中特異性靶向這些新形成的不包含內(nèi)含子的Tf1產(chǎn)物。   　 

首次證明RNA編輯顯著干預(yù)抑制Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座活性：

郝沛課題組與合作者設(shè)計了Cas13靶向Tf1中間轉(zhuǎn)錄本的兩個特異位點和隨機對照的實驗，獲得了對Tf1轉(zhuǎn)座活性的16%和60%的顯著編輯抑制效果。這些結(jié)果第一次證明了RNA編輯是對逆轉(zhuǎn)錄病原體有效的干預(yù)策略。更進一步，對比Cas13a與靶標結(jié)合被激活后（由于其亂切割活性）導(dǎo)致原核宿主細胞生長停滯的現(xiàn)象，研究者沒有觀察到Tf1在真核宿主中激活導(dǎo)致細胞停止生長的現(xiàn)象。這暗示了RNA編輯技術(shù)在真核宿主的安全性，也表明Cas13a在真核細胞與細菌細胞中的作用機制有所不同。 　 

第一次采用CRISPR-Cas12a實現(xiàn)對逆轉(zhuǎn)錄病原體DNA階段進行編輯干預(yù)：

通過設(shè)計Cas12a靶向Tf1逆轉(zhuǎn)錄本的多個特異位點（5個crRNA設(shè)計）和隨機對照的實驗，發(fā)現(xiàn)Cas12a對Tf1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的顯著編輯抑制作用（達到90%）--雖然仍有殘余的Tf1轉(zhuǎn)座發(fā)生。研究者猜測殘余的轉(zhuǎn)座活性，是由于Tf1中間產(chǎn)物被VLP包裝保護的結(jié)果。 所以更進一步，通過延長crRNA的表達時間，最終完全消除了殘余轉(zhuǎn)座活性，達到了100%的編輯干預(yù)效率。

這些研究成果，開拓了對逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進行編輯干預(yù)的新思路和新方法。比較了RNA編輯和DNA編輯的不同作用機制，完成了兩類機制對逆轉(zhuǎn)錄病原體復(fù)制和轉(zhuǎn)座的編輯干預(yù)效果的定量分析，為新技術(shù)策略發(fā)展建立了基礎(chǔ)并提供了系統(tǒng)參數(shù)。 

原文標題：

Interfering with retrotransposition by two types of CRISPR effectors: Cas12a and Cas13a