深圳子科生物報(bào)道：近期，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室在微生物學(xué)國(guó)際主流學(xué)術(shù)期刊mBio在線發(fā)表了關(guān)于肺炎克雷伯菌質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的一種新型可介導(dǎo)替加環(huán)素等藥物耐藥的多重耐藥外排泵基因簇（tmexCD1-toprJ1）的研究論文，該研究系統(tǒng)性地闡述了tmexCD1-toprJ1耐藥基因簇的功能、起源以及流行情況。

近年來(lái)，質(zhì)粒等可移動(dòng)元件介導(dǎo)的耐藥基因水平傳播所致革蘭陰性菌耐藥性的快速發(fā)展，引起全球高度關(guān)注。黏菌素和替加環(huán)素是治療多重耐藥革蘭氏陰性桿菌感染的少數(shù)有效藥物，然而，質(zhì)粒介導(dǎo)黏菌素耐藥基因mcr-1的出現(xiàn)及其在全球的廣泛傳播，導(dǎo)致黏菌素的臨床應(yīng)用價(jià)值面臨挑戰(zhàn)，使替加環(huán)素成為治療多重耐藥腸桿菌所致嚴(yán)重感染的有限藥物之一。目前，除了染色體上RND型外排泵過(guò)表達(dá)以及質(zhì)粒編碼的Tet(A)外排泵變異體和替加環(huán)素修飾酶Tet(X3)、Tet(X4)和Tet(X5)介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機(jī)制外，尚未發(fā)現(xiàn)可水平轉(zhuǎn)移的RND型外排泵與替加環(huán)素耐藥性相關(guān)的報(bào)道。

2017年，課題組分離到雞源泛耐藥肺炎克雷伯菌，同時(shí)對(duì)替加環(huán)素耐藥，通過(guò)全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌同時(shí)攜帶碳青霉烯耐藥基因（blaNDM-1）、黏菌素耐藥基因（mcr-1、mcr-8）等30個(gè)耐藥基因，未檢測(cè)到已知的替加環(huán)素耐藥機(jī)制，但發(fā)現(xiàn)攜帶一個(gè)質(zhì)粒編碼的RND型外排泵基因簇，該基因簇與銅綠假單胞菌染色體上的mexCD-oprJ基因簇有78%的核苷酸序列同源性，同時(shí)位于質(zhì)粒上具有可轉(zhuǎn)移能力，將其命名為tmexCD1-toprJ1（t表示transferable），并推測(cè)該基因簇可能與替加環(huán)素耐藥有關(guān)。通過(guò)克隆和接合實(shí)驗(yàn)，確證tmexCD1-toprJ1可介導(dǎo)肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌對(duì)甘氨酰環(huán)素類(lèi)（替加環(huán)素）、四環(huán)素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)等多種藥物耐藥（MIC值增加4～32倍），這意味著tmexCD1-toprJ1也是一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因（PMQR）。

為了證實(shí)TMexCD1-TOprJ1的外排泵功能，課題組進(jìn)一步通過(guò)細(xì)菌藥物蓄積實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攜帶有外排泵的宿主菌的藥物蓄積濃度明顯低于對(duì)照菌株，并對(duì)外排泵抑制劑N-甲基吡咯烷酮（NMP）表現(xiàn)出更為顯著的反應(yīng)。此外，小鼠感染模型的替加環(huán)素治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種tmexCD1-toprJ1陽(yáng)性肺炎克雷伯菌的小鼠死亡率更高，提示其可能會(huì)導(dǎo)致臨床治療失敗。

圖1TMexCD1-TOprJ1對(duì)替加環(huán)素體內(nèi)體外活性研究

本研究進(jìn)一步分析了tmexCD1-toprJ1的基因環(huán)境和質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)tmexCD1-toprJ1位于可接合的IncFIA型質(zhì)粒（pHNAH8I-1）上，同時(shí)該質(zhì)粒上還攜帶黏菌素耐藥基因（mcr-8）。之后通過(guò)分析這種新型外排泵基因簇的基因環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在外排泵上游存在位點(diǎn)特異性整合酶基因，與tnfxB1-tmexC1-tmexD1-toprJ1基因簇一同插入在轉(zhuǎn)座子Tn5393的轉(zhuǎn)座酶tnpA基因中。在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相應(yīng)高相似度的序列進(jìn)行比對(duì)分析后，推測(cè)外排泵基因簇可能通過(guò)假定整合酶，從染色體捕獲上并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒上傳播。之后，課題組通過(guò)構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)方法，發(fā)現(xiàn)假單胞菌染色體上存在同源性最為接近的外排泵基因簇，因此推定tmexCD1-toprJ1可能來(lái)源于某種假單胞菌染色體。

圖2 pHNAH8I-1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和tmexCD1-toprJ1基因環(huán)境比較圖

圖3 TMexD1及相關(guān)高同源性蛋白遺傳進(jìn)化樹(shù)

課題組隨后進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)tmexCD1-toprJ1主要在國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)中廣泛傳播，并已擴(kuò)散至動(dòng)物性食品和人，主要在肺炎克雷伯菌及其相近菌屬中流行。盡管tmexCD1-toprJ1在人源腸桿菌中檢出率較低，但考慮到tmexCD1-toprJ1的可轉(zhuǎn)移性和外排泵底物的廣泛性，tmexCD1-toprJ1可能會(huì)進(jìn)一步傳播，對(duì)食品安全和人類(lèi)健康構(gòu)成潛在威脅。

圖4攜帶tmexCD1-toprJ1陽(yáng)性菌株流行分布情況

本研究首次報(bào)道了一種新型的質(zhì)粒介導(dǎo)的多重耐藥RND家族外排泵，此外排泵可導(dǎo)致包括替加環(huán)素在內(nèi)的多種臨床常用藥物耐藥。因此，應(yīng)加強(qiáng)相應(yīng)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，以控制攜帶TMexCD1-TOprJ1外排泵菌株的進(jìn)一步傳播。