深圳子科生物報(bào)道：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要免疫細(xì)胞。不過，TAM是否在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中起主導(dǎo)作用還不清楚。近日，首都醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在《Cancer Letters》雜志上發(fā)文稱，外泌體miRNA通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的M2極化，促進(jìn)CXCL12/CXCR4-誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為避免結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的消化道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。盡管這種疾病的治療效果有了很大的改善，但由于發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后仍然很差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約50%的結(jié)直腸癌患者在病程中出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。

近期的多項(xiàng)研究表明，CXCL12/CXCR4軸的激活在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中起了關(guān)鍵作用，但具體機(jī)制還不大清楚。同時(shí)，基于癌癥轉(zhuǎn)移的“種子和土壤”理論，轉(zhuǎn)移前niche的形成還需要腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的交流，以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在此過程中通常維持M2極化狀態(tài)，以促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移。

那么，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化的信號(hào)來自哪里？最近有人提出，癌癥來源的外泌體（exosomes）通過轉(zhuǎn)移miRNA來指導(dǎo)轉(zhuǎn)移的器官傾向性。的確，外泌體miRNA常常充當(dāng)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的信號(hào)分子。于是，研究人員假設(shè)，表達(dá)CXCR4的結(jié)直腸癌細(xì)胞通過外泌體轉(zhuǎn)移miRNA來促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，最終促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

高表達(dá)的CXCR4促進(jìn)M2極化

為了探索CXCR4是否招募巨噬細(xì)胞并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，研究人員將CXCR4^+/-轉(zhuǎn)基因小鼠（腸道上皮細(xì)胞過表達(dá)CXCR4的小鼠，由賽業(yè)生物提供）與Apc^Min/+小鼠雜交，產(chǎn)生CXCR4^+/-Apc^Min/+復(fù)合突變小鼠。Apc^Min/+小鼠的Apc存在生殖系突變，會(huì)導(dǎo)致小鼠易患自發(fā)性結(jié)腸和腸道腫瘤，因此，這種小鼠可作為自發(fā)性結(jié)腸癌模型，以鑒定CXCR4的促腫瘤作用。

研究人員發(fā)現(xiàn)，與Apc^Min/+小鼠相比，CXCR4^+/-Apc^Min/+小鼠的結(jié)腸腺瘤數(shù)量顯著增加。同時(shí)，CXCR4的高表達(dá)導(dǎo)致M2標(biāo)志物CD163的表達(dá)顯著增加，而CXCR4^+/-Apc^Min/+小鼠的結(jié)腸粘膜中也觀察到M2巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)增加。有意思的是，CD163的表達(dá)主要位于結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)前沿和基質(zhì)。這些結(jié)果表明，CXCR4的激活與TAM浸潤(rùn)強(qiáng)度的增加之間存在著潛在的關(guān)聯(lián)。此外，通過臨床標(biāo)本的分析，他們還發(fā)現(xiàn)CXCR4的表達(dá)與M2標(biāo)志物CD206存在相關(guān)性，突出了CXCR4在結(jié)直腸癌微環(huán)境中的潛在調(diào)節(jié)作用。

來自腫瘤細(xì)胞的外泌體miRNA誘導(dǎo)M2極化

越來越多的研究表明，癌細(xì)胞大量分泌外泌體，并將信號(hào)分子轉(zhuǎn)移到周圍細(xì)胞中。為了鑒定那些導(dǎo)致巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)發(fā)生改變的外泌體miRNA，研究人員從感染了對(duì)照（HCT116-Control）、CXCR4慢病毒（HCT116-CXCR4）或經(jīng)過CXCL12處理（HCT116-CXCR12）的HCT116細(xì)胞中分離出外泌體，并利用miRNA芯片開展分析。他們發(fā)現(xiàn)，三種miRNA（miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p）在來自HCT116-CXCR4 和HCT116-CXCL12細(xì)胞的外泌體中顯著上調(diào)，表明這些miRNA是在CXCL12/CXCR4激活后高度上調(diào)的。

為了證明這些miRNA可通過外泌體從結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞，他們用FAM標(biāo)記的miRNA轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，并與PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。通過共聚焦顯微鏡可以在巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到FAM標(biāo)記的miRNA，這意味著miRNA可以通過外泌體從結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞。之后，他們將小鼠巨噬細(xì)胞和PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞與來自HCT116-control、HCT116-CXCR4和HCT116-CXCL12的外泌體共同孵育，發(fā)現(xiàn)以上三種miRNA的水平在與HCT116-CXCR4 和HCT116-CXCL12外泌體孵育的巨噬細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖1）。

為了探索這些高度上調(diào)的外泌體miRNA對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，研究人員在經(jīng)PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞攝取外泌體后，測(cè)定了M2標(biāo)志物（CD206和Arg-1）以及M1標(biāo)志物（iNOS和TNFα）的表達(dá)水平。與對(duì)照細(xì)胞相比，來自HCT116-CXCR4或HCT116-CXCL12細(xì)胞的外泌體顯著增加了CD206和Arg-1的表達(dá)，同時(shí)降低了iNOS和TNFα的表達(dá)。此外，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p的模擬物顯著增加了M2標(biāo)志物的表達(dá)，并降低了M1標(biāo)志物的表達(dá)；而miRNA抑制劑則顯著抑制了M2標(biāo)志物的表達(dá)，顯示了這些miRNA調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的特異性。

圖1. miRNA被巨噬細(xì)胞吸收并引發(fā)M2極化表型。

外泌體miRNA通過PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)M2極化

研究人員隨后利用miRNA目標(biāo)預(yù)測(cè)算法來確定這些miRNA的潛在下游靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)PTEN是它們的共同靶點(diǎn)。為了確定這一點(diǎn)，他們分別用三種miRNA的模擬物和抑制劑來轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miRNA模擬物顯著抑制了PTEN的表達(dá)，而miRNA抑制劑大大增強(qiáng)了PTEN的表達(dá)，其中miR-425-5p對(duì)PTEN的表達(dá)表現(xiàn)出最強(qiáng)的負(fù)調(diào)控潛力，表明PTEN是這些miRNA的潛在靶點(diǎn)。同樣地，Akt的表達(dá)也受到這些miRNA的負(fù)向調(diào)控，表明PTEN/PI3K/Akt是協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵信號(hào)通路（圖2）。

他們利用miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p模擬物轉(zhuǎn)染鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7和PMA誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PTEN的表達(dá)明顯降低以及PI3K-Akt信號(hào)通路的激活。同時(shí)，c-Myc、STAT3和STAT6被激活并磷酸化，以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的M2極化。與預(yù)期的結(jié)果一致，M1表型標(biāo)志物iNOS的水平降低，而M2表型標(biāo)志物Arg-1的表達(dá)大大增加。這些結(jié)果表明，miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p從結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到巨噬細(xì)胞后，通過PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路協(xié)同增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的M2極化。

 
圖2. 外泌體miRNA通過PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化。

M2極化的巨噬細(xì)胞促進(jìn)EMT和血管生成

為了探索M2極化的巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，研究人員將巨噬細(xì)胞與結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物后的THP-1和Raw264.7細(xì)胞明顯增強(qiáng)了遷移能力，并促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。之后，通過細(xì)胞因子分析，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)miRNA轉(zhuǎn)染的Raw264.7細(xì)胞條件培養(yǎng)基中VEGF這種血管生成因子顯著增加。同時(shí)，血管形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也表明，M2極化巨噬細(xì)胞分泌的VEGF可顯著促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的血管形成，表明促血管生成作用是巨噬細(xì)胞引發(fā)結(jié)直腸癌侵襲的機(jī)制之一。

為了進(jìn)一步評(píng)估外泌體miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用，研究人員以4:1的比例將結(jié)直腸癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染了miRNA模擬物的巨噬細(xì)胞混合，然后將這些細(xì)胞注射到裸鼠的側(cè)腹。他們發(fā)現(xiàn)，這些巨噬細(xì)胞的共注射會(huì)導(dǎo)致異種移植瘤的體積明顯增加。而且，巨噬細(xì)胞的促腫瘤作用可通過IL-4的處理而得到加強(qiáng)。之后，他們還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p的THP-1細(xì)胞中，小鼠出現(xiàn)了更多的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA的巨噬細(xì)胞在體內(nèi)促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展和肝轉(zhuǎn)移（圖3）。

圖3. 轉(zhuǎn)染miRNA的巨噬細(xì)胞促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展和血管生成。

血清中的外泌體miRNA與結(jié)直腸癌患者的轉(zhuǎn)移相關(guān)

最后，為了確定結(jié)直腸癌患者血清中的外泌體miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p水平是否升高，研究人員從健康供體和結(jié)直腸癌患者的血清中提取出循環(huán)外泌體。RT-qPCR顯示，結(jié)直腸癌患者的循環(huán)外泌體水平上調(diào)。而且，與沒有轉(zhuǎn)移的患者相比，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的循環(huán)外泌體中miR-25-3p和miR-130b-3p的水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)外泌體中的miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p水平可作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的非侵入性方法。

作者總結(jié)道：“我們證明，結(jié)直腸癌細(xì)胞在響應(yīng)CXCL12/CXCR4激活時(shí)，通過外泌體轉(zhuǎn)移一組miRNA（miR-25-3p、miR-130b-3p和miR-425-5p）而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化，從而增強(qiáng)EMT和結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（如下圖所示）?！彼麄冋J(rèn)為，外泌體miRNA不僅可以作為預(yù)后的預(yù)測(cè)工具，還可以作為避免結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。

原文檢索

D. Wang, X. Wang, M. Si, J. Yang, S. Sun, H. Wu, S. Cui, X. Qu, X. Yu, Exosome-encapsulated miRNAs contribute to CXCL12/CXCR4-induced liver metastasis of colorectal cancer by enhancing M2 polarization of macrophages, Cancer Letters,