深圳子科生物報(bào)道：DNA依賴(lài)性蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）是一種新型誘導(dǎo)劑，可促進(jìn)線(xiàn)粒體凋亡并抑制腫瘤生長(zhǎng)，但它在心血管疾病中的作用仍不清楚。最近，解放軍總醫(yī)院和復(fù)旦大學(xué)等機(jī)構(gòu)的研究人員闡釋了DNA-PKcs在心臟缺血再灌注損傷中的作用。

這篇題為“DNA?PKcs promotes cardiac ischemia reperfusion injury through mitigating BI?1?governed mitochondrial homeostasis”的文章于2020年1月發(fā)表在《Basic Research in Cardiology》雜志（IF：6.470）上。

背景

大量證據(jù)表明，線(xiàn)粒體損傷后心肌細(xì)胞死亡的關(guān)鍵作用是提示心肌缺血再灌注（IR）損傷，但這背后的病理調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。DNA-PKcs是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）家族中的成員，其作用是響應(yīng)各種應(yīng)激條件，如衰老、輻射和氧化應(yīng)激等。近期的多項(xiàng)研究提示，DNA-PKcs可能是線(xiàn)粒體損傷的罪魁禍?zhǔn)?，并且與Bax參與的線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)。

Bax介導(dǎo)的線(xiàn)粒體凋亡是從Bax轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體外膜開(kāi)始的。Bax插入線(xiàn)粒體外膜，使其更具滲透性，從而引發(fā)凋亡的執(zhí)行。Bax抑制劑（BI-1）是一種高度保守的細(xì)胞死亡抑制劑，在細(xì)胞死亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。盡管BI-1與不同的生理和病理過(guò)程相關(guān)，但其在心血管系統(tǒng)中的作用還不大清楚?？紤]到DNA-PKcs會(huì)促進(jìn)Bax相關(guān)的線(xiàn)粒體凋亡，研究人員此次想了解DNA-PKcs在心臟缺血再灌注損傷和線(xiàn)粒體損傷中的潛在作用，其重點(diǎn)放在BI-1。

DNA-PKcs缺失可減輕IR損傷引起的心肌炎癥

為了評(píng)估IR損傷時(shí)心臟DNA-PKcs的變化，研究人員檢查了總體和磷酸化DNA-PKcs。與對(duì)照相比，Ser2056處的DNA-PKcs磷酸化在再灌注6小時(shí)后達(dá)到峰值，且氧化應(yīng)激在DNA-PKcs活化中起作用。為了進(jìn)一步了解DNA-PKcs在IR損傷中的作用，他們制備了心肌細(xì)胞特異性的DNA-PKcs敲除（DNA-PKcs^CKO）小鼠，并對(duì)其進(jìn)行IR處理。結(jié)果表明，IR誘導(dǎo)的DNA-PKcs磷酸化在DNA-PKcs^CKO小鼠中不再出現(xiàn)，且IR損傷引起的心肌梗死和TUNEL凋亡也顯著減輕。更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IR介導(dǎo)的氧化狀態(tài)在DNA-PKcs激活中起作用，導(dǎo)致氧化性心肌細(xì)胞死亡。

研究人員發(fā)現(xiàn)，與DNA-PKcs^f/f小鼠相比，DNA-PKcs^CKO小鼠的DNA-PKcs缺失大大減輕了IR處理引起的心臟功能受損。此外，IR損傷明顯增加了粘附分子ICAM-1，而其作用因DNA-PKcs缺失而減輕。同時(shí)，DNA-PKcs^CKO心臟中粘附分子的減少導(dǎo)致心肌中Gr1+中性粒細(xì)胞的募集減少，表明DNA-PKcs在心肌再灌注炎癥反應(yīng)中具有誘導(dǎo)作用。相應(yīng)地，DNA-PKcs的缺失抑制了再灌注介導(dǎo)的促炎因子的升高。這些結(jié)果表明，DNA-PKcs的破壞保護(hù)小鼠免受IR損傷介導(dǎo)的心臟功能障礙（圖1）。

圖1. 再灌注介導(dǎo)的心臟功能障礙和心臟炎癥反應(yīng)在DNA-PKcsCKO小鼠中得到緩解。

DNA-PKcs缺失可阻止Bax相關(guān)的線(xiàn)粒體凋亡

線(xiàn)粒體凋亡是在IR損傷中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵事件。于是，研究人員想了解IR介導(dǎo)的心肌線(xiàn)粒體凋亡是否歸因于DNA-PKcs的活化。數(shù)據(jù)表明，缺氧復(fù)氧（HR）損傷促進(jìn)了mPTP的開(kāi)放和Caspase-9/3的激活，而這些反應(yīng)被DNA-PKcs缺失所抑制。考慮到DNA-PKcs與Bax之間的正相關(guān)關(guān)系，他們接著檢測(cè)了DNA-PKcs缺失是否可通過(guò)清除線(xiàn)粒體Bax（mito-Bax）來(lái)對(duì)抗線(xiàn)粒體凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，IR損傷上調(diào)了mito-Bax的水平，而DNA-PKcs缺失下調(diào)了mito-Bax的水平。同時(shí)，DNA-PKcs的缺失也與線(xiàn)粒體抗凋亡分子（如Bcl2）的增加密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，DNA-PKcs缺失可阻止IR損傷引發(fā)的Bax相關(guān)的線(xiàn)粒體凋亡。

BI-1在IR損傷環(huán)境中維持線(xiàn)粒體的功能

BI-1是一種促生存分子，可能促進(jìn)了DNA-PKcs缺失對(duì)線(xiàn)粒體損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)表明，IR損傷導(dǎo)致DNA-PKcs^f/f小鼠中的BI-1表達(dá)顯著下降，而DNA-PKcs的缺失在再灌注的早期和晚期均阻止BI-1的下調(diào)，揭示IR損傷中BI-1與DNA-PKcs之間呈負(fù)相關(guān)（圖2）。

為了進(jìn)一步證實(shí)DNA-PKcs對(duì)BI-1表達(dá)的作用，他們通過(guò)Ad-DNA-PKcs轉(zhuǎn)染在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)DNA-PKcs。在HR處理后，Ad-DNA-PKcs轉(zhuǎn)染以劑量依賴(lài)的方式引起DNA-PKcs的磷酸化，并導(dǎo)致BI-1的表達(dá)水平降低。相反，DNA-PKcs的缺失逆轉(zhuǎn)了IR-誘導(dǎo)的BI-1水平下降。這些結(jié)果再次確認(rèn)了DNA-PKcs是BI-1上游的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。后續(xù)實(shí)驗(yàn)表明，DNA-PKcs通過(guò)促進(jìn)蛋白酶體降解，對(duì)BI-1的穩(wěn)定性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

圖2. DNA-PKcs缺失使得心肌細(xì)胞中的BI-1穩(wěn)定。

研究人員懷疑，DNA-PKcs缺失所帶來(lái)的心臟保護(hù)作用是否要?dú)w因于BI-1的上調(diào)。為了檢驗(yàn)這種假設(shè)，他們生成了心肌細(xì)胞特異性的DNA-PKcs/BI-1雙缺陷小鼠。與對(duì)照相比，IR損傷在BI-1^CKO小鼠中造成了更明顯的心臟損傷，相比之下，DNA-PKcs^CKO小鼠的梗死面積更少，TUNEL+細(xì)胞更少，心臟損傷減弱，而心臟功能改善。有意思的是，BI-1缺失抵消了DNA-PKcs缺失所帶來(lái)的保護(hù)作用（圖3）。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs缺失以BI-1依賴(lài)的方式大大減弱了HR介導(dǎo)的線(xiàn)粒體Bax轉(zhuǎn)位。

圖3. BI-1缺失抵消了DNA-PKcs缺失對(duì)再灌注心臟的保護(hù)作用。

鑒于線(xiàn)粒體在心臟IR損傷中的主要作用，他們繼續(xù)研究了DNA-PKcs/BI-1信號(hào)級(jí)聯(lián)在線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)中的作用。他們利用免疫熒光法檢測(cè)評(píng)估了線(xiàn)粒體的形態(tài)。再灌注刺激迫使線(xiàn)粒體分裂成碎片，并伴隨著線(xiàn)粒體分裂相關(guān)蛋白（如p-Drp1和Mff）的表達(dá)增加。有意思的是，DNA-PKcs缺失保留了線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，抑制了分裂相關(guān)因子。然而，BI-1缺乏又抵消了DNA-PKcs缺失對(duì)線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)的保護(hù)作用。

為了進(jìn)一步鞏固BI-1在再灌注心臟中的有益作用，研究人員又采用了BI-1^TG小鼠。與對(duì)照組相比，BI-1水平因再灌注而下調(diào)，組織學(xué)損傷增加，包括梗死區(qū)擴(kuò)大和心臟功能受損。不過(guò)，BI-1^TG小鼠在IR損傷后表現(xiàn)出梗死面積明顯減少和心肌功能的改善。此外，在BI-1^TG小鼠中，再灌注介導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡和Bax相關(guān)的線(xiàn)粒體凋亡大大減弱。這些數(shù)據(jù)表明，對(duì)于心臟再灌注損傷，BI-1蛋白的重新引入對(duì)心臟有益，并維持了線(xiàn)粒體完整性。

結(jié)語(yǔ)

“我們的數(shù)據(jù)表明，DNA-PKcs為響應(yīng)IR損傷而激活，通過(guò)抑制BI-1導(dǎo)致心肌細(xì)胞的線(xiàn)粒體凋亡。這些結(jié)果首次描述了DNA-PKcs/BI-1級(jí)聯(lián)在線(xiàn)粒體失調(diào)和心肌死亡發(fā)病中的關(guān)鍵作用，” 作者在文中寫(xiě)道。他們認(rèn)為，在管理心肌再灌注損傷時(shí)，DNA-PKcs-BI-1有望作為治療靶點(diǎn)。