深圳子科生物報(bào)道：?CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是RNA嵌合體和靶DNA之間的堿基配對(duì)，另一部分是Cas9蛋白和一個(gè)短DNA序列，這個(gè)短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端發(fā)現(xiàn)，被稱(chēng)為間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），它存在于病毒DNA中，但不存在于細(xì)菌DNA中，有助于防止細(xì)菌DNA被自身的免疫系統(tǒng)（CRISPR）切割。

PAM序列在我們的DNA中也很常見(jiàn)，因此CRISPR-Cas9已被用于編輯人類(lèi)基因組，但是有一定的限制性，不接近PAM的基因不能作為靶點(diǎn)。沒(méi)有一個(gè)相鄰、可識(shí)別的PAM序列，Cas酶將無(wú)法識(shí)別或成功附著并切割所需的DNA片段。

包括經(jīng)典的化膿性鏈球菌Cas9的變體（SpCas9）在內(nèi)不同的Cas酶可識(shí)別不同的PAM序列，但基因組的大部分仍然無(wú)法設(shè)靶編輯或更容易產(chǎn)生脫靶突變。例如，SpCas9和SaCas9（來(lái)自金黃色葡萄球菌）所識(shí)別的PAM序列多含鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報(bào)導(dǎo)的堿基編輯系統(tǒng)無(wú)法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區(qū)域進(jìn)行精準(zhǔn)堿基編輯操作。特別是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列進(jìn)行識(shí)別，以至于其作用限制僅為基因組的9.9％，靶向區(qū)域十分局限。

為了克服這個(gè)障礙，過(guò)去麻省理工大學(xué)（MIT）的研究小組曾開(kāi)發(fā)過(guò)一種名為SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析軟件（通過(guò)目標(biāo)隊(duì)列來(lái)搜索PAM），對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行生物信息學(xué)搜索，以尋找是否存在任何具有限制性較低的PAM的Cas9樣酶序列。然后，從生物信息學(xué)搜索中創(chuàng)建出最佳匹配的合成版本，并評(píng)估它們?cè)贑RISPR系統(tǒng)中的效用。但如果一個(gè)感興趣的基因組區(qū)域碰巧沒(méi)有合適的PAM，工程師就得求助另一種Cas酶。

現(xiàn)在，哈佛醫(yī)學(xué)院的生化學(xué)家Benjamin P. Kleinstiver博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組設(shè)計(jì)了不需要特定PAM就能結(jié)合和切割DNA的Cas9蛋白變體，命名為SpG和SpRY，能夠?qū)^大多數(shù)人類(lèi)基因組進(jìn)行不受限打靶，并具有單堿基對(duì)精度，從而糾正心臟病、II型糖尿病、骨質(zhì)疏松癥和慢性疼痛等疾病的相關(guān)突變。

3月26日，科學(xué)家們?cè)凇禨cience》雜志發(fā)表了這篇具有重要意義的文章。Kleinstiver博士團(tuán)隊(duì)用新方法糾正了過(guò)去位于“不可編輯”基因組區(qū)域的人類(lèi)疾病相關(guān)突變。

“這些工程蛋白可以更自由地靶向過(guò)去不可接近的基因組區(qū)域，”Kleinstiver說(shuō)?！巴ㄟ^(guò)幾乎完全放寬Cas酶對(duì)PAM的識(shí)別要求，基因編輯的應(yīng)用被極大地拓展了。最令人興奮的意義是，從DNA編輯角度來(lái)看，全部基因組都可‘治療’了！”

“雖然未來(lái)需要更精確地闡明SpG和SpRY的氨基酸替換的分子作用，我們推測(cè)SpRY通過(guò)去除典型的堿基特異性相互作用，置換PAM DNA以促進(jìn)相互作用來(lái)達(dá)到其擴(kuò)大靶向的范圍，”作者指出。“在PAM主溝中，通過(guò)添加新的非特異性蛋白質(zhì)：DNA接觸進(jìn)行能量補(bǔ)償。更實(shí)際的是，當(dāng)考慮用哪種酶進(jìn)行需要打靶活性的實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們建議用野生型SpCas9用于承載NGG PAMs的站點(diǎn)，用SpG用于 NGH PAMs，用SpRY編輯剩余的NHN PAMs?！?/p>

原文檢索：Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants