深圳子科生物報道：如今，越來越多的證據(jù)表明，藥物解毒是在生物鐘的控制下進行的。生物鐘似乎是通過調(diào)節(jié)藥物代謝酶和外排轉(zhuǎn)運蛋白的表達來調(diào)節(jié)藥物解毒。不過，CLOCK等時鐘蛋白是否調(diào)節(jié)藥物解毒以及如何調(diào)節(jié)，目前還不大清楚。

為此，暨南大學(xué)藥學(xué)院的吳寶劍教授團隊評估了CLOCK蛋白在藥物代謝和解毒中的作用。他們發(fā)現(xiàn)，CLOCK蛋白通過細胞色素P450家族來調(diào)節(jié)代謝和藥物解毒。該研究首次建立了Clock基因與CYP代謝之間的分子聯(lián)系，并有助于時間治療的實施，也就是根據(jù)時間藥理學(xué)的知識來提高療效和減少不良反應(yīng)。

這篇題為“Role of the CLOCK protein in liver detoxification”的文章于2020年1月發(fā)表在《British Journal of Pharmacology》雜志上。

Clock基因是最早被發(fā)現(xiàn)和鑒定的生物鐘基因。它編碼BHLH/PAS轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，在節(jié)律時鐘的組織中起著核心作用。Clock基因突變的小鼠會出現(xiàn)心律失常，其晝夜節(jié)律基因表達的模式也會受到破壞。此外，CLOCK還參與了許多生理過程的調(diào)節(jié)，如細胞周期、脂質(zhì)代謝、葡萄糖代謝和免疫應(yīng)答。

細胞色素P450酶系（CYPs）負責(zé)了絕大多數(shù)藥物的體內(nèi)代謝。CYPs代謝通常將藥物分子轉(zhuǎn)化成生物學(xué)上無活性的代謝物。但是在某些情況下，CYPs代謝產(chǎn)物是有毒的。目前已經(jīng)鑒定出人類和小鼠的許多直系同源CYP基因，比如人CYP2B6 vs 小鼠Cyp2b10，人CYP2A6 vs小鼠Cyp2a5等。CYP酶在肝臟中高度表達，這支持肝臟作為藥物解毒的主要器官，特別是在靜脈注射藥物時。

Clock敲除破壞了CYP表達的晝夜節(jié)律

為了闡明CLOCK蛋白對肝臟解毒的作用，研究人員此次委托賽業(yè)生物建立了多個基因敲除小鼠品系，包括Clock敲除（Clock-/-）小鼠品系。該小鼠模型是利用CRISPR/Cas9技術(shù)刪除第9-13個外顯子而構(gòu)建的。

qPCR分析表明，小鼠肝臟中的許多解毒基因都受到CLOCK的調(diào)控，如Cyp2a4、Cyp2a5、Cyp2b10、Cyp3a11和Cyp3a25等。值得注意的是，Cyp2a4和Cyp2a5是Clock缺陷小鼠中下調(diào)幅度最大的兩個基因，而Cyp2b10是上調(diào)幅度最大的基因。此外，Clock刪除使得小鼠肝臟中Cyp2a4、Cyp2a5和Cyp2b10 mRNA及蛋白的晝夜節(jié)律被破壞。這些數(shù)據(jù)都表明，CLOCK蛋白在CYP酶（特別是CYP2A4/5和CYP2B10）的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用。

CLOCK調(diào)控Cyp2a4/5和Cyp2b10的表達

之后，研究人員利用Hepa‐1c1c7小鼠肝癌細胞和AML‐12小鼠正常肝細胞評估了CLOCK對Cyp2a4/5表達的調(diào)控作用。Clock的過表達導(dǎo)致這兩種細胞中Cyp2a4/5的表達明顯增加，而Clock的敲低導(dǎo)致Cyp2a4/5的表達下降，支持CLOCK對Cyp2a4/5的正調(diào)控。通過熒光素酶報告基因檢測、EMSA實驗和ChIP分析，他們發(fā)現(xiàn)CLOCK通過與啟動子區(qū)域中的E-box元件直接結(jié)合而激活Cyp2a4/5的轉(zhuǎn)錄（圖1）。

圖1. CLOCK通過與E-box直接結(jié)合而激活Cyp2a4/5的轉(zhuǎn)錄。

同樣地，他們利用這兩種細胞評估了CLOCK對Cyp2b10表達的調(diào)控作用。實驗結(jié)果表明，Clock過表達導(dǎo)致Hepa‐1c1c7和AML‐12細胞中Cyp2b10表達的降低，而Clock敲低導(dǎo)致Cyp2b10表達的增加。之前的研究提出REV‐ERBα是Cyp2b10的轉(zhuǎn)錄阻遏物，而Rev‐erbα/β是CLOCK的直接靶基因。因此，他們又研究了REV‐ERBα/β在CLOCK對Cyp2b10的調(diào)控中發(fā)揮的作用。與預(yù)期的一致，多個實驗證實了CLOCK對Rev‐erbα/β的正調(diào)控作用。

研究人員還通過細胞和遺傳實驗證實了REV‐ERBα/β對Cyp2b10的負調(diào)控。接下來，通過熒光素酶報告基因檢測、EMSA實驗和ChIP分析，他們證實了REV-ERBα/β與Cyp2b10的啟動子區(qū)域直接結(jié)合。綜上來看，CLOCK通過REV-ERBα/β而抑制Cyp2b10的轉(zhuǎn)錄（圖2）。

圖2. CLOCK通過REV-ERBα/β來調(diào)節(jié)Cyp2b10。

Clock缺失讓小鼠對香豆素和環(huán)磷酰胺的毒性敏感

之后，研究人員以香豆素（coumarin）和環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide）為例，研究了CLOCK蛋白如何參與肝臟解毒。

在小鼠中，香豆素可通過CYP2A4/5解毒為7-羥基化代謝物。他們發(fā)現(xiàn)，香豆素處理會誘導(dǎo)野生型小鼠的肝毒性，且毒性具有晝夜節(jié)律性。不過，在Clock-/-小鼠中，毒性的時間差異不再存在。同時，Clock-/-小鼠的香豆素毒性水平升高，這是因為CYP2A4/5的表達下調(diào)了?？傊?，Clock缺失通過下調(diào)CYP2A4/5介導(dǎo)的代謝而加劇香豆素的毒性，并削弱其晝夜節(jié)律（圖3）。

圖3. Clock缺失削弱了香豆素毒性的晝夜節(jié)律。

環(huán)磷酰胺被廣泛用于各種癌癥的治療。它是一種藥物前體，在小鼠中被CYP2B10生物激活為4‐OH‐CPA。環(huán)磷酰胺處理可在野生型小鼠中引起肝毒性，且肝毒性嚴重程度取決于給藥時間。不過，在Clock-/-小鼠中，環(huán)磷酰胺肝毒性的時間依賴性消失了。由于CYP2B10表達上調(diào)，毒性代謝物4‐OH‐CPA的形成增加，導(dǎo)致小鼠的環(huán)磷酰胺毒性水平較高。這些結(jié)果表明，Clock缺失通過上調(diào)CYP2B10代謝使小鼠對環(huán)磷酰胺的毒性敏感，并調(diào)節(jié)其晝夜節(jié)律（圖4）。

圖4. Clock缺失加重了環(huán)磷酰胺的毒性并調(diào)節(jié)其晝夜節(jié)律。

結(jié)論

作者表明，CLOCK蛋白是一系列CYP酶以及香豆素和環(huán)磷酰胺解毒的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。機理研究表明，CLOCK通過直接與啟動子上的E-box結(jié)合而激活CYP2A4/5，并通過REV‐ERBα/β來抑制CYP2B10的表達。這些結(jié)果將有助于在臨床上實施時間治療。

原文檢索

Zhao M, Zhao H, Deng J, Guo L, Wu B. Role of the CLOCK protein in liver detoxification. Br J Pharmacol. 2019 Dec;176(24):4639-4652. doi: 10.1111/bph.14828. Epub 2019 Dec 28.